His標(biāo)簽是蛋白純化中經(jīng)常會(huì)用到的標(biāo)簽，但是很多小伙伴在做蛋白純化時(shí)會(huì)遇到各種問(wèn)題，這里小編就總結(jié)了常見(jiàn)的一些問(wèn)題。
1. 通過(guò)His標(biāo)簽純化的蛋白，雜質(zhì)比較多？
可能原因1：蛋白酶會(huì)部分降解目的蛋白
解決方法：加入多種蛋白酶抑制劑改進(jìn)。
可能原因2：雜質(zhì)蛋白與鎳柱親和力較強(qiáng)
解決方法：可提高雜質(zhì)蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度。
可能原因3：雜蛋白和目的蛋白結(jié)合
解決方法：可通過(guò)超聲前加入去垢劑或者還原劑消除（1%-2%Tritonx-100）。
可能原因4：洗滌不充分
解決方法：增加洗滌的次數(shù)，充分洗滌。
2. 融合蛋白不掛金屬螯合親和層析柱？
可能原因1：超聲的功率不對(duì)（太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒(méi)有釋放）
解決方法：改變超聲功率或超聲前嘗試添加溶菌酶增加細(xì)胞破碎率。
可能原因2：組氨酸標(biāo)簽暴露不*
解決方法：在變性條件下（用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍）進(jìn)行純化，常規(guī)Ni-6FF(IDA) ，在變性條件下鎳離子容易脫落，此時(shí)可選擇耐受變性劑的螯合填料（推薦月旭材料的親和填料Ni Tanrose FF(NTA)）。
可能原因3：His標(biāo)簽丟失
解決方法：
1.WB 檢查His是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變His-tag的位置(C- 端或N- 端)，必要時(shí)增加His個(gè)數(shù)；
2.孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間；
3.改變螯合的金屬離子，尋找到z jia的結(jié)合金屬離子；
4.選擇高載量高特異性的螯合填料（月旭材料的親和填料 Ni Tanrose FF（IDA) )。
3. 使用幾次后Ni柱載量下降，掛柱效率低，如何處理？
可能原因：逐漸積累沉淀，變性或非特異結(jié)合的蛋白占據(jù)了有效的結(jié)合位點(diǎn)，而通過(guò)洗脫液無(wú)法*清洗所致
解決方法：
較溫和的清洗方法：用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌，然后用5倍體積的緩沖液洗滌，以去除沉淀或變性物質(zhì)。用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌，以去除疏水結(jié)合的物質(zhì)。若改變不明顯，可選擇強(qiáng)烈清洗方式。
強(qiáng)烈清洗方式：首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩沖液（20 mM 磷酸鈉, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4）洗滌，進(jìn)行脫鎳操作，然后用5－10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，后用5－10倍柱體積的雙蒸水沖洗；隨后進(jìn)行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體積的1.5 M NaCl溶液，然后10倍柱體積的雙蒸水沖洗；去除沉淀或變性蛋白，可以用1M氫氧化鈉溶液，結(jié)合1－2小時(shí)，然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗，然后10倍柱體積的雙蒸水洗滌；后進(jìn)行生鎳操作，用0.1M硫酸鎳上柱，隨后5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌，如需保存，保存在20%乙醇溶液。
4. 融合蛋白結(jié)合在螯合填料上洗脫不下來(lái)？
可能原因1：洗脫條件太溫和（融合蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）
解決方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來(lái)找出z jia的洗脫條件。
可能原因2：降低pH的方法洗脫，若pH低于3.5，會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落
解決方法：改變洗脫辦法，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。
可能原因3：蛋白已沉淀在柱上
解決方法：
1. 減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍）；
2. 蛋白在柱上變性固化，用0.5M氫氧化鈉洗柱。
可能原因4：非特異性疏水或其他相互作用
解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度。
可能原因5：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集
解決方法：選擇合適載量的填料，切勿一味追求高載量。
5. 使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)堵塞嚴(yán)重，且流速越來(lái)越慢？
可能原因：樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致
解決方法：樣品處理過(guò)程中，高速離心，z hao用0.45um的濾膜過(guò)濾（推薦）。如果柱子堵塞嚴(yán)重，重生時(shí)使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。流速慢，可在柱子下面接一根軟管。
6. 鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事？
可能原因：緩沖液中DTT的影響， DTT會(huì)對(duì)鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會(huì)被DTT還原生成棕色的沉淀，所以要盡量避免DTT的參與
解決方法：若樣品中含有DTT，在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運(yùn)行來(lái)除去任何較弱結(jié)合的鎳離子；空白運(yùn)行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）
1）5倍柱體積的雙蒸水洗柱；
2）5倍柱體積的平衡液洗柱；
3）5倍柱體積的洗脫液洗柱；
4）10倍柱體積的平衡液平衡。
當(dāng)不使用時(shí)，勿將Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含還原性試劑的緩沖液中。
7. 上清渾濁，是用IDA好還是NTA好？
上清渾濁，推薦適當(dāng)稀釋上清，并再次離心或者過(guò)0.45um濾膜處理。Ni Tanrose 6FF（IDA）或Ni Tanrose 6FF（NTA）都可純化。
8. 填料是否可以重復(fù)使用？可以使用多少次?
如果維護(hù)的好的話，填料在其效期之內(nèi)可以一直重復(fù)使用。如果每次都是純化同樣的蛋白就沒(méi)有必要?jiǎng)冸x掉鎳離子重新掛鎳，一般經(jīng)過(guò)5-7次純化之后可以進(jìn)行脫鎳和再生鎳的操作。如果柱子反壓高了，填料需要做*的在位清洗CIP，在清洗之前，為了避免金屬鹽的沉淀，需要?jiǎng)冸x掉鎳離子，然后再重新掛鎳，清洗后保存在20％的乙醇中。填料的壽命因使用的環(huán)境，純化的樣品的特性，保存方式等都有直接關(guān)系。
月旭科技秉持分享傳承生物制藥相關(guān)技術(shù)，匯集生物制藥相關(guān)細(xì)分技術(shù)，以生物技術(shù)分享傳承和助力發(fā)展為初衷，月旭科技是集生物分離純化介質(zhì)研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的G新技術(shù)企業(yè)。
公司專注生物分離填料的研制和生物工藝下游技術(shù)工藝開發(fā)。有瓊脂糖微球填料，葡聚糖微球填料，瓊脂糖交聯(lián)葡聚糖微球填料，瓊脂糖交聯(lián)纖維素微球填料，瓊脂糖交聯(lián)纖維素交聯(lián)葡聚糖微球填料，涵蓋離子交換，親和，排阻和疏水等多款高品質(zhì)填料。
